В 1866 году Нобель обнаружил, что мощность нитроглицерина стабилизирует кизельгур — тонкопористая осадочная порода, состоящей из кремниевых скелетов одноклеточных морских организмов, водорослей-диатомей. Он смешал нитроглицерин с кизельгуром и в 1867 году получил патент на свое открытие — динамит.
Интерес к динамиту был исключительно велик, и в ряде стран началось строительство заводов для его производства. В этот период шведский инженер и изобретатель проявил себя как выдающийся предприниматель и хороший финансист. Вместе с тем он продолжал свои исследования в области химии и создавал новые, еще более эффективные взрывчатые вещества. В 1887 году после многочисленных экспериментов он получил бездымный нитроглицериновый порох — баллистит. Продукция динамитных заводов Нобеля быстро завоевала международный рынок и приносила огромные доходы. Сам Нобель при этом был ярым пацифистом и поддерживал связи с некоторыми общественными деятелями конца XIX века, занимавшимися подготовкой Конгресса в защиту мира.
27 ноября 1895 года Нобель написал второе завещание, отменяющее первое. В новом тексте завещания говорилось, что все его состояние следует превратить в деньги, которые должны быть вложены в надежные акции и другие ценные бумаги,— они и образуют фонд. Ежегодные доходы от этого фонда должны быть разделены на пять частей и распределены следующим образом: одна часть дается за крупнейшее открытие в области физики, вторая — за крупнейшее открытие или изобретение в области химии, третья — за открытия в области физиологии и медицины, остальные две части предназначаются для награждения лиц, достигших успехов в области литературы или движения за мир.
После выполнения всех формальностей идея Нобеля стала реальностью: 29 июня 1900 года устав фонда был утвержден парламентом Швеции. Первые Нобелевские премии были присуждены в 1901 году.